联系我们

上海龙旸生物科技有限公司

上海龙旸生物科技有限公司

联系人:张先生

电 话:18721249786,18721249786

传 真:

手 机:13918484428

网 址:http://www.Sh-longyang.com

地 址:上海市杨浦区邯郸路100弄61号楼179室

邮 编:200433

邮 箱: 1873073193@qq.com longyangbiotech@163.com


公司资讯

酵母双杂交系统原理及应用流程

发布日期:2022-04-03

酵母双杂交系统

1.原理

  酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现,许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如,酵母的转录激活因子GAL4,在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD),C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合,而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是,单独的DNA结合域不能激活基因转录,单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

2.试验流程

  酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点,通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质,其大致步骤为:  

2.1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait),将其与DNA结合域融合,构建成诱饵质粒。  

2.2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合,构建成文库质粒。  

2.3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。  

2.4、酵母细胞中,已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用,但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用,则可激活报告基因的转录;反之,则不能。利用4种报告基因的表达,便可捕捉到新的蛋白质。

3.特点 优点

蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点

  尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法,但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用,这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白,都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性,即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清,可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用,从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题

  真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提,构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只有明了双杂交的原理,才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备,并能对实验结果作出预测与分析,尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别

于其他实验的特点,而其操作技术本身并不十分困难。特别应提出的是,一个阳性克隆的编号往往要被反复记录多次,因此,要时时注意编号的正确性。另外,若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库,应注意不同的公司有不同的产品,且各公司的产品不断更新换代,要认真阅读实验指导手册,以防出现失误。

4.应用

研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白—蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。相信随着分子生物学技术的发展与推广,酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。